Главная / Специалистам / Анализ влияния молекулы 7-гидроксиматаирезинола (Лигнариус) на клетки опухоли молочной железы человека (линия MCF7)

Анализ влияния молекулы 7-гидроксиматаирезинола (Лигнариус) на клетки опухоли молочной железы человека (линия MCF7)

Громова О.А., Торшин И.Ю., Рубашкина А.Н., Лапочкина Н.П.

Абстракт

Установление эффектов противоопухолевых средств на транскриптом (т.е. совокупность мРНК всех генов, экспрессируемых в заданном типе клеток) – важная процедура постгеномной фармакологии, необходимая для комплексной оценки желательных и нежелательных эффектов лекарств-кандидатов. В работе представлены результаты хемотранскриптомного анализа молекулы 7-гидроксиматаирезинола (7ГМР) по отношению к клеткам опухоли молочной железы (линия MCF7) в условиях инкубации клеток с 7ГМР в течение 24 ч. Достоверные дозозависимые эффекты влияния 7ГМР на транскрипцию генов (что соответствует изменению транскрипции на 5% или более на 1 мкмоль 7ГМР) показаны для 3468 из 12700 аннотированных генов человека. Анализы с использованием функциональной аннотации генов по международной номенклатуре «GO» показали, что 7ГМР достоверно снижал экспрессию генов, вовлеченных в поддержание пролиферации клеток (401 ген, в т.ч. гены, участвующие в поддержании теломер), синтез белка (194 генов) и протеасомную деградацию белков (70 генов), энергетический метаболизм опухолевых клеток (91 ген) и хроническое воспаление (148 генов). Уменьшение экспрессии этих групп генов тормозит процессы пролиферации и жизнедеятельности, одновременно защищая организм от избыточного воспаления. Параллельно, 7ГМР способствовал преимущественному повышению транскрипции групп генов, вовлеченных в противоопухолевое действие (более 100 генов), в т.ч. генов, участвующих в поддержании противоопухолевого иммунитета, а также генов, опосредующих противоопухолевые эффекты витамина D, ретиноидов и витамина С. Эти изменения в транскрипции генов усиливают эффекты воздействия 7ГМР на белки протеома и указывают на перспективы использования 7ГМР для эффективной и безопасной профилактики и терапии узловой мастопатии и рака молочной железы.

Ключевые слова: хемотранскриптомика, 7-гидроксиматаирезинол, интеллектуальный анализ данных, молекулярная фармакология, Лигнариус

Введение

Лигнан 7-гидроксиматерезинол (7ГМР) был выделен из стандартизированных экстрактов хвойных деревьев (ель, пихта белая, сосна и др.). 7ГМР проявляет антиоксидантные, противовоспалительные, противомикробные и противоопухолевые свойства. Систематический анализ экспериментальных и клинических исследований7-ГМР указал на высокую биоусвояемость (>50%) и низкую токсичность молекулы. Установлены противовоспалительные свойства 7-ГМР, обусловленные ингибированием белка NF-κB, опосредующего провоспалительные эффекты ФНО-α [1] и, предположительно, ингибированием 5-липоксигеназы, рецептора лейкотриена b4 и рецептора простациклина [2].

Наиболее изученными являются противоопухолевые свойства 7-ГМР (на примере препарата Лигнариус). В экспериментах показано, что 7-ГМР ингибирует рост гепатомы, опухолей молочной железы, матки, предстательной железы и аденоматозной полипозной кишечной неоплазии [1]. Нами было показано, что 7ГМР дозозависимо тормозит рост солидной карциномы Эрлиха даже на фоне приёма эстрадиола. Противоопухолевый эффект 7-ГМР был наиболее выражен при использовании 120 мг/сут 7-ГМР: на 21-ые сутки средний объём снижался на 620 мм³, что было достоверно ниже, чем в группе контроля (D=»0.59, P=0″.00036). Приём 120 мг/сут 7-ГМР достоверно тормозил интенсивность роста опухолевых узлов на фоне приёма эстрогенов: средний объём опухолевого узла на 21-ые сутки снижался на 322 мм³ (P=»0.007) [3]. Хемореактомное моделирование свойств молекулы 7-ГМР показало, что противоопухолевые свойства 7-ГМР могут реализоваться посредством антиоксидантного эффекта (ингибирование гемоксигеназы-2), ингибирования белков, циклин-зависимых киназ 3/4, ингибирования эффектов фактора роста эпидермиса и белка mTOR [2].

Помимо ингибирования тех или иных белков протеома, современный подход к изучению фармакологического действия лекарств предполагает обязательную оценку эффектов этой молекулы на геном (совокупность всех генов данного организма), транскриптом (совокупность всех мРНК транскриптов, синтезируемых в ходе экспрессии генома), протеом (совокупность всех белков, синтезируемых на основании мРНК транскриптома), метаболом (совокупность всех метаболитов, найденных в клетках и жидкостях данного организма) и реактом (совокупность всех химических реакций, протекающих в клетках и тканях организма). Большинство лекарств, как правило, воздействуют на активность тех или иных белков протеома, что, в свою очередь, оказывает воздействие на метаболом, реактом и, затем, на состояние транскриптома (Рис. 1) [4].

Рис. 1. Фармакологическая активность 7-гидроксиматаирезинола в постгеномной парадигме.

Как правило, для подавляющего большинства уже имеющихся лекарств и лекарств-кандидатов данные о воздействии на транскриптом отсутствуют. Однако, в рамках современной парадигмы фармакологии изучать эффекты лекарств на транскрипцию генов принципиально необходимо, т.к. транскриптомные исследования указывают на долговременные последствия приёма лекарств [5]. Дело в том, что 90% лекарств оказывают непосредственное и быстрое, "тактическое" действие (минуты-часы) за счёт ингибирования активности конкретных белков протеома (например, ингибирование аспирином фермента ЦОГ-2, что снижает синтез провоспалительных простагландинов).

В то же время, белки синтезируются на основе информации, закодированной в геномной ДНК и первым шагом в синтезе любого белка является транскрипция соответствующего гена (т.е. синтез матричной РНК, из которой затем синтезируется соответствующий белок). Воздействие лекарства на транскрипцию генов обуславливает более долговременные эффекты этого лекарства (часы-дни). Соответственно, транскрипционные эффекты лекарств также нуждаются в оценке, т.к. они привносят определённые "стратегические" изменения в транскрипции всего генома.

Изучение долговременных, транскриптомных эффектов лекарств особенно важно в случае противоопухолевых препаратов. Дело в том, что формирование резистентности опухолевых клеток осуществляется, в основном, на уровне протеома (активируется cеквестрация, метаболизм и выведение лекарств, повышается репарация ДНК, подавляются апоптотические сигнальные каскады, удлиняется пребывание клетки вне фазы клеточного цикла, усиливается взаимодействие с ростовыми факторами и цитокинами и др.) [6]. Поэтому, резистентность опухолевых клеток к действию того или иного препарата вырабатывается гораздо сложнее, если препарат не только «тактически» ингибирует тот или иной белок протеома, но и «стратегически» снижает экспрессию генов, важных для выживания и пролиферации опухолевых клеток.

Накопленный в фармакологии опыт показывает, что далеко не всякое лекарство оказывает надлежащее "тактическое" воздействие на протеом и соответствующее "стратегическое" действие на транскриптом. Например, некоторые противоопухолевые средства действительно ингибируют транскрипцию генов, ассоциированных с ростом опухолей (что и обуславливает основное фармакологическое действие молекул). Однако, те же самые молекулы нарушают активность многочисленных белков протеома, что приводит к тяжёлым побочным эффектам. Поэтому, в современной фармакологии важно учитывать воздействие исследуемого лекарства и на протеом, и на транскриптом.

В настоящей работе представлены результаты исследования дозозависимых эффектов воздействия 7-гидроксиматаирезинола на транскрипцию 12700 аннотированных генов человека в линии опухолевых клеток MCF7 (рак молочной железы) при стимуляции клеток молекулой 7ГМР в 6 различных концентрациях в течение 24 ч. В результате проведенного анализа установлены функциональные группы генов и конкретные гены, экспрессия которых дозозависимо и достоверно изменяется под воздействием 7-гидроксиматаирезинола. Соответственно, была получена комплексная картина возможных воздействий молекулы 7ГМР на транскриптом человека и найдены новые, ранее не известные, механизмы противоопухолевого действия 7-гидроксиматаирезинола.

Материалы и методы

Отметим, что транскриптомные исследования лекарств in vitro требуют комплекса специального оборудования для анализа экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов, крайней аккуратности в выборе анализируемых клеточных культур, обработке получаемых данных и, поэтому, весьма дорогостоящи (от 10000 до 20000 евро на транскриптомное исследование только 1-ой молекулы). В общем случае, такого рода исследования практически недоступны ни в России, ни за рубежом для подавляющего большинства врачей-исследователей.

 В то же время, в базе данных GEO (Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) накоплены результаты более чем 160000 транскриптомных исследований (>50000 терабайт транскриптомных данных). С использованием новейших методов искусственного интеллекта для анализа «сверхбольших данных» (big data) в Институте фармакоинфоматики при ФИЦ ИУ РАН был разработан метод хемотранскриптомного анализа эффектов молекул.

Результаты транскриптомных экспериментов в базе данных GEO представлены в виде таблиц, столбцам которой соответствуют гены, а строкам – соответствующие воздействия на клетку (например, те или иные молекулы). Элементами таблицы являются изменения экспрессии гена при соответствующем воздействии. Каждой такой «таблице транскриптомного эксперимента» соответствуют (1) тип клеток, для которых изучались изменения экспрессии, (2) интенсивность воздействия (прежде всего, концентрации воздействующих молекул) и (3) время воздействия (6 ч, 12 ч, 24 ч и др.). Изменения экспрессии оцениваются относительно контроля (как правило, ДМСО, диметилсульфоксид).

            При задании (1) типа клеток (например, эпителий), (2) концентрации и (3) времени воздействия каждый столбец такой таблицы соответствует химической реакции «Ген_i à мРНК_i», в результате которой  осуществляется синтез i-ой молекулы мРНК_i, соответствующей i-ому гену (Ген_i). Данные, содержащиеся в таком столбце таблицы T транскриптомного эксперимента, включающей информацию об изменении экспрессии N генов при воздействии n молекул, могут рассматриваться как описание определённого элемента реактома (т.е. совокупности всех химических реакций). Соответственно, становится возможным применение теории хемографов [7], методологии хемоинформационного  [8] и хемореактомного анализа  [9, 10] для осуществления хемотранскриптомного моделирования.

Хемотранскриптомный анализ. Исходным выборкой информации для обучения алгоритмов хемотранскриптомного анализа является i-ый  столбец таблицы , соответствующий i-ому гену и содержащий информацию о структуре j-ой воздействующей  молекулы (хемограф ) и изменение транскрипции (экспрессии) генов при воздействии данной молекулы, . Хемограф (χ-граф) – особая разновидность графа (т.е. математического объекта, являющегося как совокупности  множества вершин и множества ребер — связей между вершинами). Хемографом называется конечный, связный, неориентированный,  размеченный граф без петель, с кликовым числом не превышающим 3.

Данные, представленные в столбцах , обрабатываются методами хемоинформационного анализа, основанными на комбинаторной теории разрешимости [11-13]. Комбинаторная теория разрешимости, представляющая собой развитие алгебраического подхода к задачам распознавания, является современным математическим инструментом для исследования признаковых описаний объектов. В применении к анализу хемографов, практически важны теорема о полноте кортежей инвариантовпроизвольного хемографа и теорема соответствия критерия полноты инварианта критерию разрешимости/регулярности [11] на основании которых становиться возможным определение и настройка («обучение») функций расстояния между хемографами.

При использовании метрики Хэмминга, функция расстояния между хемографами  над бинарными χ-инвариантами определяется как , где χ  — множество элементарных χ-инвариантов (всех возможных фрагментов химических структур),  — кортеж-инвариант (список фрагментов структур, применимый к структуре любой молекулы),  — способ вычисления бинарных признаковых описаний для хемографа , соответствующих фрагментам молекулярной структуры из множества χ,  — вес k-го признака. Приведённое выше выражение, отражающее «химическое расстояние» между двумя произвольными молекулами  и , является основой хемоинформационного анализа вообще и хемотранскриптомного анализа, в частности.

Расстояние  является настраиваемой метрикой, т.к. содержит произвольно настраиваемые параметры — веса . Для набора данных, заданных i-ым столбцом () таблицы T транскриптомного эксперимента, настройка вектора параметров  может осуществляться теми или иными методами машинного обучения. Мы используем метод хемометрического анализа, который подразумевает использование процедуры согласования пар метрик, одной из которых является «химическое расстояние» , а второй – метрика , вычисляемая на основе значений изменений экспрессии , представленных в столбце . Согласование заключается в подборе таких значений весов , при которых различия между значениями согласуемой пары метрик, и , минимально.

Задача машинного обучения для согласования метрик формулируется как , где L – используемая функция потерь (сумма квадратов невязок, стандартное отклонение и т.п.).  Соответственно, в результате обучения алгоритма «химическое расстояние»  между парой молекул  и  соответствует различию в значения в значениях изменений экспресии и , отражаемых метрикой  с точностью до линейного преобразования , т.е. .  

В целом, на первом этапе хемотранскриптомного анализа для i-го гена, описываемого столбцом  таблицы T проводится обучение алгоритмов для вычисления химических расстояний.

На втором этапе, для исследуемой молекулы  рассчитываются расстояния  до всех хемографов  столбца  и, по формуле , вычисляются оценки расстояний  от искомого изменения экспрессии  до известных значений  столбца . Затем, для каждой j-ой молекулы по формуле  вычисляются оценки искомого изменения экспрессии, образующие множество чисел , к которому применяется оператор  для формирования эмпирической функции распределения (э.ф.р.), так что . С использованием полученной э.ф.р.  искомое изменение экспрессии  вычисляется как математическое ожидание , а точность вычисления  — как стандартное отклонение .  Представленные далее в таблицах и рисунках оценки изменений экспрессии различных констант были получены как математическое ожидание и дисперсия соответствующей эмпирической функции распределения.

На третьем этапе, для исследуемой молекулы  для каждого гена вычисляются оценки  при различных концентрациях  вещества. Графики в координатах  анализируются методами регрессионного анализа и выявляются достоверные дозозависимые тренды изменения экспрессии в зависимости от . Отбираются только те кривые , которые могут быть описаны достоверными линейными трендами (коэффициент корреляции 0.6 и более, P<0.05 по критерию Колмогорова-Смирнова) во всем диапазоне исследуемых концентраций (0.01…10 мкмоль 7-гидроксиматаирезинола).  Для каждого из отобранных трендов устанавливается знак измения экспрессии i-го гена («+»-тренд — достоверное повышение экпрессии при увеличении концентрации 7-гидроксиматаирезинола, «-»-тренд — достоверное снижение экспрессии i-го гена при увеличении концентрации 7-гидроксиматаирезинола) и соответствующие трендам гены подразделяются на список генов, для которых показано достоверное повышение экспрессии группу генов и список генов со сниженной экспрессией. К двум полученным спискам генов применяются методы системно-биологического анализа.

Системно-биологический анализ. Списки генов с достоверным повышением или снижением экспрессии генов, которые были получены в результате применения описанного выше хемотранскриптомного подхода, анализировались посредством метода функционального связывания [4]. Анализ проводится с использованием международной номенклатуры GeneOntology (GO), описывающей физиологические функции генов и соответствующих белков. Данный метод основан на системном рассмотрении органов, тканей, клеток и их мельчайших компонентов – белков, ДНК, метаболитов (в т.ч. витаминов и других микронутриентов), в рамках фундаментальных основ молекулярной биологии и биохимии. Так, на основе информации определенной геномной ДНК синтезируется соответствующий белок, выполняющий строго очерченный круг специфических функций. Как мутации гена, так и дефициты кофакторов белка (ионов металлов – кальция, магния, цинка; витаминов группы B и др.) будут приводить к падению активности тех или иных белков и проявлению той или иной специфической клинической симптоматики.

Метод анализа функциональных взаимосвязей, соединяя данные различных уровней (данные о моногенных заболеваниях, биохимические данные о кофакторах белков, данные о клеточных ролях белков, симптоматику и критерии диагностики заболеваний и т. д.) позволяет систематически рассмотреть все возможные функциональные эффекты воздействия 7-гидроксиматаирезинола на транскрипцию каждого из генов. В целом, при использовании метода анализа функциональных взаимосвязей для каждого гена человека составляется аннотированная таблица изменений экспрессии генов, включающая следующие описания:

• соответствующий гену белок,

• список биохимически необходимых эссенциальных кофакторов белка (в т.ч. с указанием потребности ионов кальция для активности рассматриваемого белка),

• список моногенных заболеваний, связанных с полной или частичной потерей активности этого белка,

• список клеточных функций белка (по номенклатуре GO и др.),

• список отдельных симптомов заболеваний, список диагнозов по МКБ-10 и другая информация из баз данных.

Далее, в полученной таблице выделяются гены, частота встречаемости функциональных описаний которых существенно отличается при достоверном повышении экспрессии по сравнению с достоверным снижением экспрессии и проводятся последующие анализы их функций на основании статистических критериев. Для статистической обработки результатов исследования использовались методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверки статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение прогнозируемых и наблюдаемых частот встречаемости исследуемых признаков проводилось с помощью критерия χ-квадрат, T-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни и тест Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Хемотранскриптомный анализ эффектов молекулы 7ГМР на опухолевые клетки линии MCF7 (24 ч инкубации) показал достоверные дозозависимые эффекты 7ГМР на транскрипцию (P<0.05 по t-тесту, коэффициент корреляции более 0.50, изменение транскрипции более 5% на 1 мкмоль 7ГМР). Достоверные изменения транскрипции были показаны для 3468 из 12700 аннотированных генов человека: экспрессия 1387 генов снизилась («Список-»), а экспрессия 2081 гена повысилась («Список+»).

Для установления детальных закономерностей в группах генов, экспрессия которых дозозависимо повышалась или снижалась при моделировании воздействия 7ГМР, был проведен сравнительный системно-биологический анализ двух списков генов («Список-» и «Список+»). В ходе проведения системно-биологического анализа были выявлены различия в частоте встречаемости ключевых слов в описаниях генов (данные UNIPROT), функциональных категорий генов/белков по номенклатуре GO (GeneOntology), данных о встречаемости различных кофакторов, ассоциированные с генами заболевания и элементы реактома человека.

С использованием категорий международной номенклатуры GO, описывающей функции генов и соответствующих белков, было выявлено по меньшей мере 56 категорий GO, частота встречаемости которых достоверно отличается между двумя списками генов, «Список-» и «Список+». Экспертный анализ позволил рубрицировать эти 56 категорий в 6 функциональных групп генов: «Протеасомная деградация белков», «Пролиферация клеток», «Синтез белка», «Энергетический метаболизм», «Хроническое воспаление», «Противоопухолевое действие» (Таблица 1). На Рис. 2А отражены профили частот встречаемости генов этих 6 функциональных групп в зависимости от количественного изменения экспрессии гена на 1 мкмоль 7ГМР.

Рис. 2. Частоты встречаемости генов каждой из 6 функциональных групп, экспрессия которых дозозависимо изменяется при воздействии 7ГМР на клетки линии MCF7 (по результатам хемотранскриптомного анализа). А) Профили частоты встречаемости генов функциональных групп. Б) Линейные аппроксимации профилей частот для наиболее выраженных зависимостей. Очевидно, что экспрессия генов систематически снижается во всех группах кроме группы «Противоопухолевое действие». В) Попарное сравнение частот встречаемости генов 6 групп.

А)

Б)

В)

Таблица 1. Категории международной номенклатуры GO, частота встречаемости которых достоверно отличалась между двумя списками (гены со сниженной экспрессией при воздействии 7-гидроксиматаирезинола, гены с повышенной экспрессией). «n-», число генов со сниженной экспрессией при воздействии 7-гидроксиматаирезинола; «n+», число генов со повышенной экспрессией при воздействии 7-гидроксиматаирезинола; Р, статистическая достоверность различий по критерию χ2.

На Рис. 3 отображены числа генов «n-» и «n+», соответствующие функциональным категориям генов, перечисленным в Таблице. Анализ линейных аппроксимаций профилей частот встречаемости генов 6 функциональных групп (Рис. 2Б) и данных на Рис. 3 позволяет утверждать очевидное систематическое снижение экспрессии генов из групп «Протеасомная деградация белков», «Пролиферация клеток», «Синтез белка», «Энергетический метаболизм», «Хроническое воспаление» на фоне повышения экспрессии генов из группы «Противоопухолевое действие».

Рис. 3 Функциональные аннотации по номенклатуре GeneOntology (GO) и изменения экспрессии генов, вызываемые 7ГМР (по результатам хемотранскриптомного анализа). Красным цветом обозначены группы генов по аннотации GO, экспрессия которых преимущественно повышалась. Синим цветом обозначены группы генов, экспрессия которых преимущественно снижалась.

Таким образом, гены, экспрессия которых дозозависимо повышается при воздействии 7-гидроксиматаирезинола, существенно отличаются по своим биологическим функциям от генов, экспрессия которых дозозависимо понижается (на что наглядно указывают диаграммы процентных соотношений функциональных групп генов, см. Рис. 2В, Рис. 4). Установленные изменения транскрипции имеют важную физиологическую интерпретацию.

Рис. 4. Процентные соотношения встречаемости функциональных групп генов со сниженной и с повышенной экспрессией при воздействии 7ГМР на клетки MCF7, 24ч (по результатам хемотранскриптомного анализа).

Во-первых, хемотранскриптомный анализ 7ГМР указывает на систематическое снижение экспрессии генов, вовлечённых как в синтез белков (194 гена), так и в деградацию белков на протеасомах (70 генов, Таблица 1), что соответствует общему снижению интенсивности внутриклеточного гомеостаза белков. Снижение протеасомального распада белков способствует снижению хронического воспаления (каскад NF-kB, см. далее) и, одновременно, увеличению продолжительности активации апоптотических сигнальных каскадов. Снижение синтеза белка (в т.ч. митохондриального синтеза белка, сплайсинг мРНК, транспорта и фолдинга белков) соответствует снижению количества ферментов, обеспечивающих метаболизм ксенобиотиков; количества белков, осуществляющих эффекты ростовых факторов и количества белков, участвующих в энергетическом метаболизме клетки (синтезе АТФ).

Во-вторых, снижение под воздействием 7ГМР экспрессии генов, вовлеченных в энергетический метаболизм (в т.ч. митохондриальные комплексы I/III дыхательной цепи, цикл трикарбоновой кислоты, комплекс пируватдегидрогеназы и др., Таблица 1) соответствует долговременному, «стратегическому»снижению обеспеченности опухолевых клеток АТФ. Соответственно, 7ГМР будет снижать энергообеспеченность опухолевых клеток, что способствует снижению интенсивности процессов пролиферации.

В-третьих, 7ГМР способствует снижению транскрипции генов, непосредственно вовлечённых в пролиферацию опухолевых клеток (поддержание теломер, ремонт (репарация) ДНК, репликация ДНК, G1/S переход при митозе, поддержание прогрессии клеточного цикла и др.). В частности, снижение активности теломеразы соответствует уменьшению числа возможных делений клетки, а снижение ремонта ДНК является одним из механизмов преодоление резистентности опухолевых клеток к терапии [6].

В-четвёртых, снижение транскрипции генов из функциональной группы «Хроническое воспаление» очевидным образом синергидно с описанным ранее противовоспалительным действием 7ГМР на протеом. Установлено, что 7ГМР ингибирует эффекты провоспалительного сигнального белка NF-kB[1]. По всей видимости, данный механизм осуществляется за счет предотвращения протеасомной деградации регуляторного белка Iκ-B. Взаимодействуя с регулятором Iκ-B, транскрипционный фактор NF-kB не может перемещаться в клеточное ядро и активировать экспрессию генов, опосредующих провоспалительные эффекты цитокина ФНО-альфа.

В-пятых, 7ГМР преимущественно повышает экспрессию генов из группы «Противоопухолевое действие». К данной группе мы отнесли более 100 генов, кодирующих белки, стимулирующие такие противоопухолевые эффекты, как:

• снижение хемотаксиса нейтрофилов (способствующих прогрессии опухолей молочной железы [14]) и повышение хемотаксиса Т-лимфоцитов (поддерживающих естественную противоопухолевую реакцию организма [15]);

• активность сигнального пути интерферона, который стимулирует апоптоз опухолевых клеток [16];

• отрицательная регуляция протеинкиназы В (что ингибирует рост опухолевых клеток MCF7 [17])

• отрицательная регуляция ангиогенеза, что способствует замедлению роста опухолей;

• синтез тиреоидных гормонов, которые ингибируют рост и выживаемость опухолевых клеток, в т.ч. клеток линии MCF7 [18];

• хемотаксис эозинофилов, инфильтрация и дегрануляция которых внутри опухолей способствует разрушению последних [19];

• поддержка метаболизм витамина D, который является одним из важнейших противоопухолевых микронутриентов [20];

• повышение экспрессии рецептора ретиноидов RXR-α, регулирующего пролиферацию, дифференциацию и апоптоз клеток (активация рецептора RXR-α вызывает апоптоз опухолевых клеток MCF7 [21]);

• повышение экспрессии гена ABCC2, кодирующего канал-транспортер цисплатина и др.

Нами были применены и другие подходы к системно-биологическому анализу двух полученных списков генов, «Список-» и «Список+», которые подтвердили приводимые выше выводы об общем направлении транскриптомного действия 7ГМР. Например, анализ встречаемости белковых кофакторов (Таблица 2) показал, что 7ГМР способствовал преимущественному снижению экспрессии генов, которые кодируют белки с такими кофакторами как железо-серные кластеры [4Fe-4S] (15 генов, Р=»0.0015), ионы магния (80″ генов, Р=»0.00″), калия (6 генов, Р=»0.014), и железа (4 гена, Р=0″.045). Все перечисленные кофакторы играют важную роль в поддержании «клеточного дыхания» и энергетического метаболизмы опухолевых клеток, так что снижение их экспрессии соответствует противоопухолевому действию. Кроме того, 7ГМР повышал транскрипцию генов, белки которых содержат аскорбат-анион в качестве кофактора (6 генов, Р=»0.058). Как известно, аскорбиноваякислота проявляет выраженные противоопухолевые свойства[22, 23].

Таблица 2. Кофакторы белков, частота встречаемости которых достоверно отличалась между двумя списками (гены со сниженной экспрессией при воздействии 7ГМР и гены с повышенной экспрессией). «n-», число генов со сниженной экспрессией при воздействии 7ГМР ола; «n+», число генов со повышенной экспрессией при воздействии 7ГМР; Р, статистическая достоверность различий по критерию χ2.

В Таблице 3 и на Рис. 5 приведены отдельные примеры дозозависимого изменения экспрессии генов под воздействием 7ГМР, полученные в результате проведения хемотранскриптомного анализа молекулы.

Таблица 3. Примеры дозозависимого изменения экспрессии генов под воздействием 7ГМР (по результатам хемотранскриптомного анализа). %ИЭ, процент изменения экспрессии на 1 мкмоль 7ГМР.

Рис. 5. Примеры дозозависимого изменения экспрессии генов под воздействием 7ГМР (по результатам хемотранскриптомного анализа).

Как было отмечено выше, 7ГМР может приводить к снижению экспрессии генов, вовлечённых в протеасомную деградацию белков (протеолиз). Например, снижалась гена PSMB3, кодирующего субъединицу бета-3 протеасомы и, также, гена UBE3C, кодирующего убиквитин протеин лигазу E3C, которая направляет белки на деградацию на протеасоме [24]. Снижение экспрессии гена CDCA3 (белок А3 цикла деления клеток) соответствует торможению деления клеток (митоза), т.к. данный белок опосредует убиквитинирование и деградацию WEE1-киназы в фазе G2/M клеточного цикла, тем самым инициируя митоз.

Хемотранскриптомный анализ показал, что 7ГМР снижает экспрессию генов, белки которых участвуют в пролиферации опухолевых клеток. Например, снижается экспрессия гена RUVBL1, который экcпреccируется во всех видах клеток. Ген RUVBL1 кодирует ДНК-геликазу (фермент, разъединяющий нити двойной спирали ДНК) под названием «RuvB-подобный белок-1», которая участвует в транскрипционной активации генов. Белок RUVBL1 необходим для активации транскрипционных программ онкогенов и протоонкогенов, стимулирующих рост опухоли, а также для репарации ДНК. RuvB-подобный белок-1 играет существенную роль в онкогенной трансформации, вызываемой геном MYC, который принципиально необходим для пролиферации опухолевых клеток [25].

7ГМР может снижать экспрессию генов, белки которых участвуют в поддержании структуры теломер — концевых участков хромосом, которые укорачиваются в каждом цикле деления клетки, что является одной из важнейших причин биологического старения. Поддержание структуры теломер осуществляется теломеразой — ферментным комплексом, добавляющим специфическую последовательность ДНК к теломерам, тем самым стабилизируя хромосомы [26].

В частности, хемореактомный анализ 7ГМР указал на снижение экспрессии гена DKC1 (дискерин, необходим для биогенеза рибосома и поддержания теломер, скорость пролиферации клеток [27]) и гена DCLRE1B (белок-1B перекрестного ремонта ДНК, осуществляющего поддержание и защиту теломер во время S-фазы клеточного цикла). Белок, кодируемый геном DCLRE1B, необходим для формирования теломерной петли (Т-петли), защищает теломеры от ферментов ремонта ДНК, от повреждения во время репликации при участии топоизомераз TOP1, TOP2A и TOP2B [28].

Под воздействием 7ГМР может снижаться экспрессия гена NHP2. Соответствующий этому гену рибонуклеопротеин NHP2 требуется для поддержания теломер, участвуя в модификациях и внутриядерном транспорте белка TERC — РНК-компонента обратной транскриптазы ферментного комплекса теломеразы [29]. Избыточная активация теломеразы наблюдается в 90% всех раковых заболеваний человека [30], что указывает важность этого механизма в формировании и развитии опухолевых заболеваний.

Хемореактомный анализ указал на повышение под воздействием 7ГМР экспрессии генов, подавляющих развитие опухолей: гена ITIH5 (ингибитор интер-α глобулина H5, экспрессируется в молочных железах и яичниках, подавляет развитие опухолей), гена SLURP1 (белок SLURP1, поддерживает целостность слоев кератиноцитов [31], маркер поздней дифференциации кожи, обладает противоопухолевой активностью [32]), гена IFNAR2 (рецептор интерферонов альфа и бета, участвует в IFN-опосредованной активации сигнальных белков STAT1, STAT2 и STAT3 [33]) и гена SZT2 (белок SZT2, ингибирует активность mTORC1, участвует в регуляции mTORC1 глюкозой [34], играет роль в клеточном ответе на окислительный стресс [35]).

Таким образом, проведённый нами хемотранскриптомный анализ 7ГМР указал на характерные изменения транскрипции генов, способствующие снижению (1) интенсивности метаболизма белков и ДНК, (2) пролиферации опухолевых клеток и (3) хронического воспаления, что соответствует долговременному, «стратегическому» противоопухолевому действию 7ГМР.

Полученные результаты указывают на дальнейшие перспективы исследований молекулы 7ГМР. Во-первых, необходимо установить, являются ли описанные изменения в транскрипции генов результатом воздействия 7-гидроксиматаирезинола на некоторые факторы транскрипции, которые одновременно являются таргетными белками для 7ГМР. Во-вторых, следует установить, являются ли описанные выше изменения транскрипции результатом изменения сигнального состояния клеток под воздействием 7ГМР. Данный комплекс вопросов весьма сложен и не может быть однозначно разрешён в рамках настоящей статьи.

Заключение

Исследование транскриптомных эффектов препаратов представляет собой «передовой фронт» молекулярной фармакологии. Транскриптомные исследования позволяют установить неочевидные механизмы действия препаратов и очертить более детально спектр патологий, на которые может благоприятно воздействовать исследуемая молекула. Результаты проведённого нами хемотранскриптомного анализа молекулы 7-гидроксиматаирезинола (действующего вещества препарата Лигнариус) (оценка воздействия на экспрессию генов в опухолевых клетках линии MCF7) указали на несколько важных особенностей транскриптомного воздействия молекулы 7ГМР. В частности, 7ГМР снижал экспрессию генов, вовлеченных в поддержание пролиферации клеток (401 ген, в т.ч. гены, участвующие в поддержании теломер), синтез белка (194 генов) и протеасомную деградацию белков (70 генов), энергетический метаболизм опухолевых клеток (91 ген) и хроническое воспаление (148 генов). Уменьшение экспрессии этих групп генов тормозит процессы пролиферации и жизнедеятельности опухолевых клеток, одновременно защищая организм от избыточного воспаления. Параллельно, 7ГМР способствовал преимущественному повышению транкрипции групп генов, вовлеченных в противоопухолевое действие (более 100 генов), в т.ч. генов, участвующих в поддержании противоопухолевого иммунитета, а также генов, опосредующих противоопухолевые эффекты витамина D, ретиноидов и витамина С. Описанные изменения в транскрипции генов усиливают эффекты воздействия лигнанов на белки протеома и указывают на перспективы использования 7ГМР у пациенток с опухолевыми заболеваниями.

Литература

1. Громова О.А., Торшин И.Ю., Рубашкина А.Н. и др. Систематический анализ фундаментальных и клинических исследований лигнана 7-гидроксиматаирезинола. Гинекология. 2018. № 7.

2. Торшин И.Ю., Громова О.А., Рубашкина А.Н. и др. Хемореактомный анализ 7-гидроксиматаирезинола указал на молекулярные механизмы осуществления фармакологических эффектов молекулы. Фармакокинетика и фармакодинамика. 2018. № 3.

3. Громова О.А., Рубашкина А.Н., Филимонова М.В., Торшин И.Ю., Тетруашвили Н.К., Лапочкина Н.П. Адъювантная терапия лигнаном 7-гидроксиматаирезинолом как метод повышения онкологической безопасности приема эстрогенов. Эффективнаяфармакотерапия. 2018. № 13. С. 14-19.

4. Torshin I.Yu. Sensing the change from molecular genetics to personalized medicine. Nova Biomedical Books, NY, USA, 2009, In “Bioinformatics in the Post-Genomic Era” series, ISBN 1-60692-217-0.

5. Торшин И.Ю., Громова О.А. Экспертный анализ данных в молекулярной фармакологии. 2012. 748 с. ISBN 978-5-4439-0051-3.

6. Свирновский А.И. Резистентность опухолевых клеток к терапевтическим воздействиямкак медико-биологическая проблема. Международныеобзоры: клиническаяпрактикаиздоровье. 2014. № 5 (11). С. 15-38.

7. Torshin I.Y., Rudakov K.V. On the application of the combinatorial theory of solvability to the analysis of chemographs. part 1: fundamentals of modern chemical bonding theory and the concept of the chemograph. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2014. Т. 24. № 1. С. 11-23.

8. Торшин И.Ю., Громова О.А., Федотова Л.Э., Калачева А.Г., Громов А.Н., Рудаков К.В. Хемоинформационный анализ молекулы оротовой кислоты указывает на противовоспалительные, нейропротекторные и кардиопротекторные свойства лиганда магния. Фарматека. 2013. № 13 (266). С. 95-104.

9. Громова О.А., Торшин И.Ю., Федотова Л.Э., Громов А.Н. Хемореактомный анализ сукцината этилметилгидроксипиридина. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика, 2016.-N 3.-С.53-60.

10. Громова ОА, Торшин ИЮ, Федотова ЛЭ. Геронтоинформационный анализ свойств молекулы мексидола. Неврология,нейропсихиатрия, психосоматика. 2017;9(4):46–54.

11. Torshin I.Y. The study of the solvability of the genome annotation problem on sets of elementary motifs. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2011. Т. 21. № 4. С. 652-662.

12. Torshin I.Y., Rudakov K.V. Combinatorial analysis of the solvability properties of the problems of recognition and completeness of algorithmic models. part 1: factorization approach. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2017. Т. 27. № 1. С. 16-28.

13. Torshin I.Y., Rudakov K.V. On the application of the combinatorial theory of solvability to the analysis of chemographs: part 2. local completeness of invariants of chemographs in view of the combinatorial theory of solvability. Pattern Recognition and Image Analysis (Advances in Mathematical Theory and Applications). 2014. Т. 24. № 2. С. 196-208.

14. Mouchemore KA, Anderson RL, Hamilton JA. Neutrophils, G-CSF and their contribution to breast cancer metastasis. FEBS J. 2018;285(4):665-679 doi.

15. Mohammed ZM, Going JJ, Edwards J, Elsberger B, Doughty JC, McMillan DC. The relationship between components of tumour inflammatory cell infiltrate and clinicopathological factors and survival in patients with primary operable invasive ductal breast cancer. Br J Cancer. 2012;107(5):864-73 doi.

16. Wang Y, Yu X, Song H, Feng D, Jiang Y, Wu S, Geng J. The STAT-ROS cycle extends IFNinduced cancer cell apoptosis. Int J Oncol. 2018;52(1):305-313 doi.

17. Li J, Zhang J, Jin L, Deng H, Wu J. Silencing lnc-ASAH2B-2 Inhibits Breast Cancer Cell Growth via the mTOR Pathway. Anticancer Res. 2018;38(6):3427-3434 doi.

18. Rogowski M, Gollahon L, Chellini G, Assadi-Porter FM. Uptake of 3-iodothyronamine hormone analogs inhibits the growth and viability of cancer cells. FEBS Open Bio. 2017;7(4):587-601 doi.

19. Furbert-Harris PM, Laniyan I, Harris D, Dunston GM, Vaughn T, Abdelnaby A, Parish-Gause D, Oredipe OA. Activated eosinophils infiltrate MCF-7 breast multicellular tumor spheroids. Anticancer Res. 2003;23(1A):71-78.

20. Громова О.А., Торшин И. Ю. Витамин D. Смена парадигмы; под ред. Е. И. Гусева, И. Н. Захаровой. — Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2017. — 568 с. : ил. ; 25 см. — Библиогр. в конце гл. — 3000 (1-й з-д 500) экз. — ISBN 978-5-9704-4058-2 Переплет: твердый

21. Aouad P, Saikali M, Abdel-Samad R, Fostok S, El-Houjeiri L, Pisano C, Talhouk R, Darwiche N. Antitumor activities of the synthetic retinoid ST1926 in two-dimensional and three-dimensional human breast cancer models. AnticancerDrugs. 2017;28(7):757-770 doi.

22. Громова О.А., Торшин И.Ю., Филимонова М.В., Сорокина М.А. Роль витаминов в профилактике рака и их влияние на эффективность противоопухолевой терапии: систематический анализ доказательных исследований. Терапия. 2018;2(20)

23. Громова О.А., Торшин И.Ю., Мартынов А.И., Сорокина М.А., Егорова Е.Ю. Систематический анализ применения витаминов в рамках многопрофильного стационара. Терапия, том 3, № 6, с. 89-99.

24. Wang M, Cheng D, Peng J, Pickart CM. Molecular determinants of polyubiquitin linkage selection by an HECT ubiquitin ligase. EMBO J. 2006;25(8):1710-9 doi.

25. Grieb BC, Gramling MW, Arrate MP, Chen X, Beauparlant SL, Haines DS, Xiao H, Eischen CM. Oncogenic protein MTBP interacts with MYC to promote tumorigenesis. Cancer Res. 2014;74(13):3591-602 doi.

26. Olovnikov AM. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. J Theor Biol. 1973 Sep 14;41(1):181-90

27. Heiss NS, Bachner D, Salowsky R, Kolb A, Kioschis P, Poustka A. Gene structure and expression of the mouse dyskeratosis congenita gene, dkc1. Genomics. 2000;67(2):153-63 doi.

28. Ye J, Lenain C, Bauwens S, Rizzo A, Saint-Leger A, Poulet A, Benarroch D, Magdinier F, Morere J, Amiard S, Verhoeyen E, Britton S, Calsou P, Salles B, Bizard A, Nadal M, Salvati E, Sabatier L, Wu Y, Biroccio A, Londono-Vallejo A, Giraud-Panis MJ, Gilson E. TRF2 and apollo cooperate with topoisomerase 2alpha to protect human telomeres from replicative damage. Cell. 2010;142(2):230-42 doi.

29. Wang C, Meier UT. Architecture and assembly of mammalian H/ACA small nucleolar and telomerase ribonucleoproteins. EMBO J. 2004;23(8):1857-67 doi.

30. 27323951 Jafri MA, Ansari SA, Alqahtani MH, Shay JW. Roles of telomeres and telomerase in cancer, and advances in telomerase-targeted therapies. Genome Med. 2016 Jun 20;8(1):69. doi: 10.1186/s13073-016-0324-x.

31. Favre B, Plantard L, Aeschbach L, Brakch N, Christen-Zaech S, de Viragh PA, Sergeant A, Huber M, Hohl D. SLURP1 is a late marker of epidermal differentiation and is absent in Mal de Meleda. J Invest Dermatol. 2007;127(2):301-8 doi.

32. Ridge RJ, Sloane NH. Partial N-terminal amino acid sequence of the anti-neoplastic urinary protein (ANUP) and the anti-tumour effect of the N-terminal nonapeptide of the unique cytokine present in human granulocytes. Cytokine. 1996;8(1):1-5 doi.

33. Duncan CJ, Mohamad SM, Young DF, Skelton AJ, Leahy TR, Munday DC, Butler KM, Morfopoulou S, Brown JR, Hubank M, Connell J, Gavin PJ, McMahon C, Dempsey E, Lynch NE, Jacques TS, Valappil M, Cant AJ, Breuer J, Engelhardt KR, Randall RE, Hambleton S. Human IFNAR2 deficiency: Lessons for antiviral immunity. Sci Transl Med. 2015;7(307):307ra154 doi.

34. Wolfson RL, Chantranupong L, Wyant GA, Gu X, Orozco JM, Shen K, Condon KJ, Petri S, Kedir J, Scaria SM, Abu-Remaileh M, Frankel WN, Sabatini DM. KICSTOR recruits GATOR1 to the lysosome and is necessary for nutrients to regulate mTORC1. Nature. 2017;543(7645):438-442 doi.

35. Peng M, Yin N, Li MO. SZT2 dictates GATOR control of mTORC1 signalling. Nature. 2017;543(7645):433-437 doi.