N.M. Saarinen^{a ,b,*}, P.E. Penttinen^a, A.I. Smeds^c, T.T. Hurmerinta^a,b, S.I. Ma¨kela¨^a,b

^a Форум по функциональным пищевым продуктам, Университет Турку, Ita¨inen Pitka¨katu 4A, FI-20520 Турку, Финляндия

^b Институт биомедицины,  Университет Турку, Kiinamyllynkatu 10, FI-20520 Турку, Финляндия

^c Факультет органической химии, Академия Або, Biskopsgatan 8, FI-20500 Турку, Финляндия

Аннотация

Было предложено связать низкий риск развития рака молочной железы (РМЖ) с увеличением приёма лигнанов.  Некоторые растительные лигнаны преобразуются в лигнаны млекопитающих, напр. энтеролактон (ЭНЛ), который предположительно является биологически активным видом лигнанов. До настоящего времени возможной биологической активности растительных лигнанов уделялось довольно мало внимания несмотря на то, что некоторые растительные лигнаны поглощаются и присутствуют в сыворотке крови и моче. В данном исследовании мы рассмотрели противоопухолевое и эндокринно-модулирующее действие различных растительных лигнанов с целью уточнения связей структура-активность. 7-гидроксиматаирезинол (ГМР) не преобразуется в ЭНЛ, ГМР и ЭНЛ ингибируют рост 7,12-диметилбензантрацен (ДМБА)-индуцированного рака молочной железы. Нортракелогенин (НТГ) похож на ГМР, но имеет гидроксильную группу на С-8 вместо С-7 и не преобразуется в ЭНЛ.  В модели ДМБА у НТГ не было выявлено ингибиции роста опухоли, но наблюдали увеличенную массу  матки. Кроме того, пожизненное воздействие на НТГ увеличило массу матки у неполовозрелых женщин и массу вентральной доли предстательной железы у взрослых мужчин. Напротив, пожизненное воздействие на  ГМР не повлияло на массу матки или предстательной железы в любом возрасте. Наши результаты указывают на то, что разница в местоположении одной гидроксильной группы приводит к разной биологической реакции in vivo, а также к разным метаболическим профилям лигнанов.

© 2004 Elsevier Ltd. Все права защищены.

Ключевые слова: Растительные лигнаны; Лигнаны млекопитающих;  Гидроксиматаирезинол; Нортракелогенин; Энтеролактон; рак молочной железы; ДМБА

Введение

Растительные лигнаны представляют собой общераспространённую группу фенольных соединений, связанных с клетчаткой. Одним из богатейших пищевых источников растительных лигнанов являются семена льна; семена других масличных культур, цельнозерновые продукты, овощи, ягоды и фрукты также содержат лигнаны [1,2]. Некоторые пищевые растительные лигнаны, такие, как секоизоларициресинол, пинорезинол, ларицирезинол и матаирезинол преобразуются кишечной микробиотой в лигнаны млекопитающих энтеродиол (ЭНД) и энтеролактон (ЭНЛ)  [3–5], которые предположительно являются биологически активными видами лигнанов у млекопитающих.

Потребление пищи пониженной жирности и с высоким содержанием клетчатки связано с пониженным риском развития рака молочной железы (РМЖ) Предполагается, что это может быть связано с высоким приёмом растительных лигнанов, связанных с клетчаткой, которые преобразуются в ЭНЛ. В ходе некоторых эпидемиологических исследований типа "случай-контроль" обнаружили обратную зависимость между концентрацией ЭНЛ в сыворотке крови и моче и риском развития РМЖ[6–11],, в то время как в некоторых исследований не обнаружили никакой зависимости [12,13]. В большинстве недавних когортных исследованиях зависимость между ЭНЛ и риском развития РМЖ осталась неясной  [14–18]; так, вопрос о предполагаемой связи между ЭНЛ и риском РМЖ остаётся открытым.

Провели ограниченное число исследований с очищенными лигнанами ввиду недостаточного количества многих соединений.  (–)-7-гидроксиматаирезинол (ГМР, Рис. 1) является наиболее распространённым лигнаном в древесине Picea abies [19]. Кроме древесины, возможно присутствие ГМР  в съедобных растениях, так как его обнаружили в плазме крови человека, полученной из общей совокупности населения Финляндии [20], а также после приёма внутрь семян кунжута  [21]. Недавно было показано, что другой лигнан (–)-нортрахелогенин (НТГ), также называемый (–)-викстромол, встречается в других хвойных породах дерева [19,22,23]. НТГ по своей структуре похож на ГМР за исключением алифатической OH-группы на С-8 вместо С-7 у ГМР (Рис. 1). Как ГМР, так и НТГ возможно изолировать в количествах, достаточных для проведения долговременных испытаний in vivo.

Рис. 1. Структуры растительных лигнанов и лигнана млекопитающих ЭНЛ

Ранее было показано, что ГМР метаболизируется в ЭНЛ у крыс [24–26]. Конверсия ГМР в ЕНЛ также была показана in vitro в ходе исследований ферментации с фекальной микробиотой человека [5]. Было показано in vivo, что ГМР обладает противоопухолевыми свойствами. На крысах ГМР ингибировал рост верифицированного 7,12-диметилбензантрацен (ДМБА)-индуцированного рака молочной железы  [24,25], и распространение N-этил-N’-нитро-N-

нитрозогуанидин(ЭННГ)-индуцированную аденокарциному матки[27]. Следовательно, в множестве случаев кишечной неоплазии у мышей линии (Apc)Min, приём ГМР снизил число кишечных аденом [28]. Доступно ограниченное число данных о влиянии НТГ in vivo. По нашим сведениям были задокументированы лишь антилейкозные свойства (+)-НТГ [29]. В настоящее время какие-либо данные по биодоступности или метаболизму НТГ отсутствуют.

Чаще всего лигнаны относят к классу фитоэстрогенов. Большая часть исследований была направлена на изучение лигнанов млекопитающих и в частности на ЭНЛ. Данное соединение предположительно проявляет биологическую активность, действуя в качестве слабого эстрогенного агониста. ЭНЛ производит низкоаффинное связывание с эстрогенными рецепторами (ЭР) и [30], в высоких концентрациях (выше 1 М), увеличивает пролиферацию клеток MCF-7 [31–33]. Кроме того, предполагается, что ЭНЛ в клетках MCF-7 будет препятствовать ростостимулирующей активности E2 [34]. Кроме непосредственных ЭР-путей предполагается, что ЭНЛ будет стимулировать синтез сывороточного глобулина, связывающего гормоны, в клетках рака печени [35] и ингибировать биосинтез эстрогена (ароматаза) in vitro [36–38].

В данном исследовании изучили два близко похожих по структуре лигнана, ГМР и НТГ, с целью дальнейшего уточнения возможного эндокринного влияния этих лигнанов in vivo. Эндокринное модулирующее влияние ГМР и НТГ было испытано in vivo посредством измерения утеротропной реакции у неполовозрелых крыс и влияния продолжительного воздействия рациона, начиная с беременности, на органы размножения самцов крыс. В дальнейшем были повторно исследованы влияние НТГ на рост верифицированной ДМБА-индуцированной опухоли молочной железы у крыс, а также метаболизм НТГ у ДМБА-индуцированных самок и интактных самцов крыс под воздействием НТГ. В данных исследованиях мы показали, что небольшая разница в структуре растительного лигнана приводит к заметным изменениям в биологической активности in vivo, а также в метаболизме лигнанов.

Материалы и методы

1.1.     Химические соединения

(–)-ГМР   и   (–)-НТГ, изолированные из   P.   Abies и  Pinus sylvestris, соответственно, были получены от маг. ест. наук Christer Eckerman (Академия Або, Турку, Финляндия). Кислота аскорбиновая, диэтилстилбестрол (ДЭС) 7,12-диметилбензантрацен, 4-метилумбеллиферил- — d-глюкуронид, и 4-метилумбеллиферил- — d-сульфат были приобретены у Sigma Chemicals (Сент-Луис, штат Миссури, США), кунжутное масло — у Acros (Гел, Бельгия). Полиэтиленгликоль (ПЭГ, ММ 3400) был приобретён у ICN Biomedicals Inc. (Орора, штат Огайо, США) и Helix pomatia – у Biosepra (Вильнёв-ла-Гарен, Cedex, Франция). Ацетон, кислота аскорбиновая, кислота уксусная безводная, метанол, натрия ацетат и натрия азид были приобретены у  Mallinckrodt Baker B.V. (Девентер, Нидерланды). Колонки SepPak были приобретены у Waters (Милфорд, штат Массачусетс, США). Дейтерированные лигнаны, d6-ЭНЛ и d6-МР были приготовлены как указано выше [39,40].

1.2.     Животные

Во всех исследованиях использовали крыс линии Sprague–Dawley. Они были приобретены у Harlan (Хорст, Нидерланды), их поместили по 3 крысы/клетку с циклом 12 ч свет/12 ч темнота при относительной влажности 50% и свободным доступом к воде и рациону RM1 (SDS, Уитхем, Эссекс, Великобритания). Организация по содержанию лабораторных животных и этический комитет Университета Турку одобрили план экспериментов на животных. В дополнение, Административный Совет Округа дал согласие на исследование рака.

1.3.     Влияние НТГ на верифицированную ДМБА-индуцированную опухоль молочной железы у крыс

Самкам крыс возрастом 15 дней принудительно перорально ввели 12 мг ДМБА в 1 мл кунжутного масла. Начиная с 10 недели после введения, крыс поделили на две группы: (1) контрольная группа (n = 17) и (2) группа НТГ (15 мг/кг массы тела, n = 16) со схожими частотой, множественностью и объёмом опухолей.  Крысам ежедневно перорально вводили разведённый в растворе НТГ (50% ПЭГ в дистиллированной воде, содержащей 10% этанол) или один раствор. Прибавка в весе животных, потребление пищи на клетку, а также число и рост опухолей измеряли один раз в неделю в течение 58 дней. Объём опухолей (V) измеряли по формуле
V = [π(ширина)2 × (длина)]/12. Трёх крыс из контрольной группы и четырёх крыс из группы НТГ умертвили до окончания эксперимента из-за кровоточащих опухолей. В течение оставшихся недель эксперимента высчитали данные по опухоли этих крыс  при помощи установившихся объёмов опухоли и их числа. В течение последней недели эксперимента (т.е. по истечении 8 недель после введения НТГ) в метаболические клетки собрали отдельные образцы мочи за 24 часа от каждой крысы. Собранные клетки содержали 67,2 моль кислоты аскорбиновой и 18 моль натрия азида в качестве консервантов.  Записали объём центрифугированных образцов, их хранили при –20 °C. В конце эксперимента крыс умертвили, их опухоли, печень и матку отделили и записали их массу.

1.4.     Пожизненное воздействие ГМР (Исследование А) и НТГ (Исследование B)

Начиная с 5 дня перед спариванием самок крыс поместили в отдельные клетки и назначили им полуочищенный экспериментальный рацион. Контрольным самкам (трём крысам в исследовании А и шести крысам в исследовании В) назначили полуочищенный контрольный рацион. В рационе исследования А присутствовал жир (9,55%) и кукурузное масло (2,85%) в качестве источника жиров. Подробный состав рациона находится у Bylund и соавт.  [41]. В исследовании В использовали рацион C1000 (Altromin Ltd., Лаге, Германия), содержащий подсолнечное масло (5,35%) в качестве источника жиров. В обоих рационах казеин в качестве источника белков, клетчатку как источник волокна, сахарозу как источник сахара, а также кукурузный крахмал как источник полисахаридов. Подверженным воздействию лигнана самкам (n = 5 в обоих исследованиях) назначили контрольный рацион, дополненный 1,5 г ГМР или НТГ на кг рациона (0,15%). Каждую самку по отдельности спарили с одним самцом. Самкам назначили экспериментальную диету в течение всего периода беременности и лактации Записали число и пол новорождённого потомства. На 21 день постнатального периода (ПНП) потомство женского пола и часть мужского умертвили, измерили массу матки или семенников. Оставшихся самцов поместили по парам и назначили тот же экспериментальный рацион, что и до отъёма. По истечении 20 недели введения экспериментального рациона, в  метаболические клетки собрали отдельные образцы мочи за 24 часа, что описано в Разделе 2.3.. Еженедельно проверяли массы тела и объёмы потребления рациона на клетку. В обоих исследованиях А и В, распределение крыс по возрасту ко времени умерщвления было схоже во всех экспериментальных группах. В исследовании А, на 118-130 день ПНП взвесили самцов крыс и умертвили их углекислым газом перед обезглавливанием. Измерили массу семенников, добавочных половых желез (вентральная доля предстательной железы, семенные пузырьки и свёртывающие железы) и печени. В исследовании В часть самцов крыс умертвили на 40-48 день ПНП и остальных самцов на 146-148 день ПНП. Как описано выше, взвесили массу животных ,собрали и измерили образцы.

1.5.     Анализ содержания лигнанов в моче

Подготовили образца мочи согласно ранее описанной схеме Smeds и соавт. [26]. Вкратце, образца мочи (0,5 мл) были гидролизированы под воздействием ферментов и извлечены в твёрдом состоянии при pH 4,0. Внутренние стандартные образцы d6-МР и d6-ЭНЛ добавили до извлечения. После выпаривания элюента (метанола), экстракты были повторно разведены в подвижной фазе и проанализированы методом ВЭЖХ-МС/МС при мониторинге множественных реакций (ММР). Количественное определение провели при использовании стандартных образцов семи разных уровней концентрации чистых лигнанов в объединённом контрольном образце мочи.

Некоторые метаболиты НТГ отсутствовали в виде чистых соединений. Предварительную структуру данных соединений определили методом ГХ-МС. Провели полуколичественное определение соединений (т.е. высчитали относительные площади пика) в экстрактах мочи методом ВЭЖХ-МС/МС при ММР после сканирования методом ВЭЖХ-МС/МС дочерних ионов в каждом депротонированном молекулярном ионе.

2.6.     Утеротропная реакция у неполовозрелых крыс

Эстрогенность НТГ и ГМР оценили методом утеротропного испытания на неполовозрелых крысах, как указывалось ранее [42]. Вкратце, на 18 день ПНП самок крыс, которые имели свободный доступ к рациону RM3, не содержащего сою (SDS, Служба назначения специальных рационов, Уитхем, Эссекс, Великобритания) и питьевой воде, разделили на четыре экспериментальные группы. Контрольным крысам  (n = 4) давали рапсовое масло (0,1 мл/10 г массы тела), крысам с положительным контролем (n = 3) ежедневно принудительно вводили диэтилстилбестрол (ДЭС, 2 г/кг массы тела) в масле. ГМР и НТГ (50 мг/кг массы тела) давали крысам (n = 4 и 5, соответственно) в течение 7 дней, т.е. до 24 дня ПНП. На 25 день ПНП крыс умертвили и взвесили. Матки изъяли и немедленно взвесили сразу после удаления жидкости из полости матки.

2.7.    Статистический анализ

Все анализы произвели с использованием программы Statistica версия 5.1 для ОС Windows. Нормально распределённые данные (определённые при использовании теста Шапиро-Уилка на нормальность распределения) проанализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующим проведением анализа Тьюки. Не нормально распределённые данные проанализировали с использованием медианного теста Краскела-Уоллиса  с последующим проведением  U-теста Манна-Уитни. Приемлемый уровень значимости установили на  p  0,05 для всех анализов. Все данные выражены в качестве среднего ± стандартное отклонение (С.О.).

Результаты

1.6.    Влияние НТГ на ДМБА-индуцированную опухоль молочной железы у крыс

НТГ не ингибирует рост ДМБА-индуцированной опухоли молочной железы (Рис. 2) и не уменьшает множественность опухолей по сравнению с контрольными группами (Рис. 3). В соответствии с этими результатами, процентное соотношение не растущей и растущей опухолями схоже в контрольной группе и группе, придерживающейся рациона с НТГ (Рис. 4). Примечательно то, что в группе с НТГ масса матки была значительно выше по сравнению с контрольной группой в конце эксперимента. (Таблица 1). Не наблюдалось существенной разницы в массе тела  или массе печени животных (Таблица 1).

Рис. 2. Суммарный объём ДМБА-индуцированных опухолей у крыс, получавших дозу с раствором (контрольная группа  n = 17) или с (–)-нортракелогенином (НТГ, n = 16) в дозе 15 мг/кг массы тела/день. Не наблюдалось существенных различий в суммарном объёме опухолей в группах.

1.7.    Утеротропное влияние НТГ и ГМР на неполовозрелых самок крыс

Кратковременное (на 18-24 день ПНП) пероральное введение НТГ или ГМР (50 мг/кг массы тела/день) не выявило никакого значительного утеротропного влияния на неполовозрелых самок крыс (Таблица 2). Однако, продолжительное воздействие 0,15% рациона НТГ, начиная с периода беременности и до отъёма, привело к значительному повышению массы матки у неполовозрелых самок крыс (возрастом 21 день) по сравнению с контрольной группой. В схожих условиях испытания, воздействие 0,15% рациона НТ не выявило никакого влияния (Таблица 3).

Рис. 3. Множественность опухолей молочной железы у ДМБА-индуцированных крыс Крысы получали дозировку раствором (контрольная группа, n = 17) или с нортракелогенином (НТГ, n = 16) 15 мг/кг массы тела. Не наблюдали каких-либо существенных различий во множественности опухолей между группами.

Рис. 4. Процентное соотношение растущих и не растущих ДМБА-индуцированных опухолей молочной железы у самок крыс в конце эксперимента.

Таблица 1.
Масса органов не овариэктомизированных ДМБА-индуцированных взрослых самцов крыс в конце эксперимента.

Крысам каждый день давали 15 мг/кг массы тела НТГ (группы НТГ) или раствор (контрольная группа) в течение 58 дней.

* Существенно отличающаяся от контрольной группы (p < 0,05).

Таблица 2

Эстрогенность ГМР и НТГ у неполовозрелых крыс в анализе роста матки                                            

Каждое соединение принудительно вводилось пероральным путём в масле (100л/10 г массы тела) ежедневно   в течение 7 дней, начиная с возраста в 18 дней. Крысам в группе положительного контроля ежедневно подкожно вводили диэтилстилбестрол (ДЭС, 2г/кг массы тела).

* Существенно отличающаяся от контрольной группы (p < 0,05).

1.8.     Влияние НТГ и ГМР на гормоночувствительные органы самца крысы

Не наблюдалось никаких существенных различий в размере помёта или соотношении полов у самок, придерживающихся рациона с лигнанами (данные не установлены). Более того, выживаемость потомства, потребление рациона, а также увеличение массы тела крыс способствовало 0,15%

Таблица 3

Утеротропное влияние ГМР и НТГ, начиная с беременности

Рационы с лигнанами давали самкам крысы в течение беременности и кормления (т.е. помёту) до достижения потомством возраста в 21 день.

* Существенно отличающаяся от контрольной группы (p < 0,05).

ГМР или 0,15% рацион НТГ оставался схожим у контрольной группы в течение всего периода эксперимента (данные не указаны) При времени отъёма (напр, на 21 день ПНП) не наблюдали существенной разницы в массе тела или массе органов в ГМР. подверженные неполовозрелые самцы (Таблица 4). Аналогично, пожизненная выдача рациона с ГМР, начинающаяся с воздействия в утробе и продолжающаяся в зрелости (118-140 день ПНП) существенно не изменила массу органов размножения самца крысы.(Таблица 4). Между тем при пожизненной выдаче рациона с 0,15% НТГ проявилось слабое влияние на эндокринную систему самцов. На 146-148 день ПНП у самцов, получающих НТГ, масса предстательной железы была значительно выше, чем у контрольной группы  (Таблица 4). В дальнейшем наблюдалось небольшое увеличение массы семенных пузырьков и свёртывающей железы по сравнению с животными из контрольной группы, несмотря на то, что эта разница не достигла статистической значимости (p = 0,08).

1.9.     Содержание лигнанов в моче ДМБА-индуцированных самок крыс и взрослых самцов крыс

У не овариэктомизированных самок крыс ЭНД т ЭНЛ присутствовали в образцах мочи, потому что крыс содержали на фиксированном рационе с натуральными ингридиентами (RM 1). После ежедневного ввода пероральным путём НТГ в течение 8 недель (15 мг/кг массы тела) ДМБА-индуцированным самкам крыс, не отмечали существенного выведения ЭНД или ЭНЛ в сравнении с контрольной группой  (Рис. 5). Однако, другие метаболиты млекопитающих, кроме ЭНД и ЭНЛ, обнаружили в моче ДМБА-индуцированных самок крыс. Приблизительно определили деметилированные и деметоксилированные метаболиты, а также метаболиты с раскрытым циклом НТГ (Рис. 7). Как представляется, при проведении полуколичественного анализа экстрактов мочи, метаболит 2 является наиболее широко представленным метаболитом НТГ млекопитающих у самок крыс, также наблюдали широкую интраиндивидуальную вариативность в экскреции.   В дальнейшем наблюдали значительное увеличение экскреции НТГ с мочой у крыс, которым давали НТГ, по сравнению с животными, которым давали раствор (Рис. 5).

Таблица 4

Масса органов самцов крыс после продолжительного воздействия ГМР или НТГ, начиная с периода беременности.

                                                                                                     (мг ± С.О.)                                                                                             Рацион ГМР

Возраст 21 день

Рацион с лигнанами давали самкам крыс в ходе беременности и кормления. Соответствующие рационы постоянно давали потомству.

* Существенно отличающаяся от контрольной группы (p < 0,05).

У самцов выдача рациона с 0,15% НТГ в течение 20 недель значительно увеличила экскрецию НТГ с мочой по сравнению с крысами, которым давали полуочищенный (без лигнанов) контрольный рацион, однако не наблюдали существенных изменений в экскреции ЭНД или ЭНЛ (Рис. 6). Кроме того, у самцов и самок крыс не наблюдали увеличения экскреции матаирезинола после выдачи НТГ.

Рис. 5. Экскреция лигнанов с мочой у ДМБА-индуцированных самок крыс после ежедневной выдачи НТГ 15мг/кг массы тела в течение 8 недель (группа НТГ,  n = 12)  или одного раствора (контрольная группа, n = 14); энтеродиол, ЭНД; энтеролактон, ЭНЛ.

Обсуждение

Разница в месторасположении гидроксильной группы в ГМР (в С-7) по сравнению с НТГ (в С-8) проявляется в существенных различиях в метаболизме и биологической активности in vivo. Вводимый оральным путём НТГ поглощался и выводился с мочой как таковой, однако не обнаружили образования ЭНЛ. У ДМБА-индуцированных самок крыс выдача НТГ не повлияла на рост верифицированных опухолей молочной железы, но увеличила массу матки. С учётом этого, у неполовозрелых самок НТГ немного повысил рост матки, когда воздействие НТГ началось в течение беременности и продолжилось до отъёма (21 день ПНП). У самцов пожизненное воздействие НТГ, начавшееся с периода беременности до зрелости, проявилось в значительном увеличение массы вентральной доли предстательной железы. В отличие от НТГ, ГМР метаболизировался в ЭНЛ, как сообщалось ранее [24,38]. В дальнейшем обнаружили, что ГМР обладает противоопухолевым действием у крыс, несущих ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы [24,25]. В отличие от НТГ, пожизненное воздействие ГМР не повлияло на эндокринную систему на самцов или самок крыс.

Рис. 6. Выведение лигнанов с мочой у взрослых самцов крыс, которым в течение 20 недель выдавали рацион с 0,15% НТГ (n = 12) или контрольный рацион (n = 14); энтеродиол, ЭНД; энтеролактон, ЭНЛ.

1.10. Отдельное влияние лигнанов на рост вызванных раком опухолей молочной железы у крыс.

Как хорошо известно, ДМБА-индуцированные опухоли зависят от эндокринной системы, что основательно изложено Welsch [43]. У не не овариэктомизированных крыс, несущих ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы, введение эстрогенов в умеренных количествах усиливает рост раковой опухоли, тогда как овариоэктомия, антиэстрогены или блокаторы биосинтеза эстрогенов (ингибиторы ароматазы) препятствуют росту опухоли. Кроме того, продемонстрировали соответствующую реакцию массы матки у ДМБА-индуцированных крыс: Как ожидается, ввод эстрогена имеет утеротропное влияние, когда овариоэктомия, краткосрочный ввод антиэстрогенов или ингибиторы ароматазы имеют подавляющее действие на массу матки [44–46]. Таким образом, в данной модели рака можно определить соединения с возможным антиэстрогенным и эстрогенным действием, основанным на как на росте опухолей, так и на массе матки.

Лишь несколько растительных лигнанов испытали на модели роста вызванных раком опухолей молочной железы у крыс. На ДМБА-модели лигнан семян кунжута, сезамин, стал одним из первых изученных  лигнанов в пищевых продуктах. Пищевая добавка сезамин (0,2%) уменьшила множественность опухолей молочной железы при начале приёма за одну неделю до канцерогенного воздействия, однако показала лишь небольшое, незначительное уменьшение объёма опухоли после приёма в течение 13 недель [47]. С другой стороны, другой полученный из семян льна лигнан, диглюкозид секоизоларициресинола (СДГ) дозировкой 1,5 мг/крыса/день подавил рост ДМБА-индуцированных опухолей молочной железы при приёме в ходе стадии активации опухолеобразования [48,49]. Таким образом, выдача ГМР (4,7–15 мг/кг массы тела) крысам, несущим ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы, замедлило рост опухоли в ходе активации и раннего прогрессирования [24,25]. В отличие от сезамина, СДГ и ГМР, выдача НТГ в течение восьми недель в ходе активации и раннего прогрессирования (т.е. начиная с того момента, когда опухоли уже были верифицированы) ДМБА-идуцированным крысам не показало подавления роста опухоли молочной железы в сравнении с контрольной группой.

Кроме разного влияния на рост опухоли, похожие по структуре лигнаны имеют разные реакции на рост матки у ДМБА-индуцированных не овариэктомизированных самок крыс. Введение ГМР не привело к значительному увеличению массы матки [24,25]. Однако в ходе настоящего исследования наблюдалась увеличенная масса матки у крыс, принимающих НТГ, что предполагает эстроген-подобную реакцию НТГ in vivo. У ДМБА-индуцированных крыс не сообщалось о влиянии воздействия СДГ на массу матки [48]. Эти результаты свидетельствуют об остутстствии явной эстрогенной активности СДГ или ГМР.

Кроме ДМБА-модели использовали другие модели канцероген-зависимого рака молочной железы у крыс с целью испытания воздействия лигнанов на крыс. У крыс, несущих N-метил-N-нитрозомочевина (НМО) зависимые опухоли молочной железы, введение СДГ уменьшило инвазивность и степень злокачественности опухоли [50]. Однако, не наблюдалось существенных изменений в объёме опухоли, предполагается, что СДГ замедляет прогрессирование опухоли [50]. В другой модели, в которой использовали наиболее широко распространённый гетероциклический амин в приготовленной пище, 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо (4,5-b) пиридин (PhIP), с целью стимулирования опухолей молочной железы у крыс испытали влияние арктиина (гликозид арктигенина, Рис. 1) на опухолеобразование [51]. Выдача арктиина (0,02 или 0,2% в рационе) крысам после возбуждения PhIP снизило множественность опухолей молочной железы [51]. Однако, другой лигнан трахелозид (глюкозид трахелогенина, схожий с арктиином, кроме наличия гидроксильной группы на C-8 (Рис. 1), не показал существенного ингибирования числа или роста опухоли при введение в ходе периода возбуждения или после возбуждения канцерогена [52]. Исходя из этих данных о ГМР и НТГ в ДМБА-модели, а также арктиина и трахелозида в PhIP-модели рака молочной железы предполагается, что эти соединения с гидроксильной группой на C-8 не имеют противоопухолевой активности.

1.11. Является ли ЭНЛ важным медиатором противоонкологических свойств при раке молочной железы?

Метаболизм растительных лигнанов у лигнанов млекопитающих может сыграть важную роль в отношении противоопухолевой активности.  Было предложено, что ЭНЛ является биологически активным метаболитом лигнана. У крыс СДГ и ГМР метаболизировались в ЭНД и ЭНЛ соответственно [3,24,53]. У крыс, несущих ДМБА-опухоль, СДГ и воздействие семян льна привело к весьма значительной отрицательной корреляции между объёмом верифицированной опухоли и экскреции с мочой лигнана млекопитающих (ЭНД+ЭНЛ), что предполагает важность метаболитов млекопитающих в качестве противоопухолевого средства [49]. В дальнейшем определили, что лигнан арктигенин, форма агликона арктиина, который проявил ингибирование опухолей молочной железы у крыс [51], действует как предшественник ЭНЛ [5]. Ввиду этого, метаболиты лигнанов млекопитающих также могут отчасти объяснять противоопухолевые свойства арктиина. В качестве дальнейшей поддержки, выдача рацемического ЭНЛ (10 мг/кг массы тела) ингибировала ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы у крыс [38]. Однако, в отличие от СДГ, ГМР и арктиин, НТГ не проявил противоопухолевых свойства на поздних стадиях опухолеобразования. Также не наблюдали образования ЭНЛ из НТГ, несмотря на обнаружение других метаболитов (гидроксилированных C-8) в моче (Рис. 7). Соответственно, до настоящего времени не сообщалось об образовании ЭНЛ из трахелогенин или трахелозида (без противоопухолевой активности).

Кроме того, другие факторы, за исключение образования ЭНЛ, могут быть важными медиаторами противоонкологических свойств лигнанов. Ранее уделялось довольно мало внимания разнице в поглощении растительных лигнанов. Биодоступность разных растительных лигнанов значительно отличается. Некоторые растительные лигнаны, такие как ГМР, поглощаются в значительных количествах, тогда как другие, как секоизоларициресинол и матаирезинол, поглощаются лишь в малых количествах [26]. Как и ГМР, НТГ поглощается и выводится с мочой в значительных количествах. С учётом этого, арктигенин и трахелогенин в значительных количествах обнаружили в сыворотке крови крыс после выдачи арктиина и трахелозида соответственно [54]. В дальнейшем следует отметить, что некоторые растительные лигнаны также могут подвергнуться химическим (не в печени, не бактериальным) превращениям. Например, после выдачи ГМР крысам, эпи-, изо- ГМР [55], и после выдачи ларициресинола, циклоларицирезинол [56] был обнаружен в моче крыс. Вследствие этого, растительные лигнаны и их дальнейшие метаболиты также могут быть биологически активными, и нельзя исключать возможность того, что они действуют в качестве модуляторов роста опухоли.

Рис. 7. Метаболиты НТГ млекопитающих предварительно обнаружены в моче самок крыс.

1.12.Лигнаны в качестве эндокринных модуляторов

Лигнаны и в особенности ЭНЛ предположительно действовали как эндокринные модуляторы, что объяснило бы противоопухолевые свойства при раке, зависимом от гормонов, как рак молочной железы. Как сообщается, in vitro ЭНЛ слабо связывается с ЭР и с очень слабым действием трансактивирует ЭР [30]. Таким образом, не обнаружили каких-либо существенных изменений в трансактивации посредством ЭР или ЭР в присутствии или отсутствии E2 [24]. Однако сообщили о слабом эстрогенном и антиэстрогенном действии в ЭР-положительных клетках MCF-7 [31–33]. ЭНЛ (1-10 М) увеличило пролиферацию клеток, тогда как сочетание ЭНЛ и Е2 привело к низкой пролиферации клеток MCF-7, чем отдельное действие ЭНЛ или Е2 [34]. Также сообщалось о том, что ЭНЛ стимулирует синтез сывороточного глобулина, связывающего гормоны (СГСГ) в клетках рака печени HepG2[35],и ингибировало связывание гормонов с СГСГ [57]. Далее было предложено, что ЭНЛ ингибирует ферменты биосинтеза гормонов, такие как 5-редуктаза  [58] и ароматаза [36–38].

Эстрогенность растительных лигнанов редко изучалась несмотря на то, что лигнаны часто заносят в класс фитоэстрогенов. По нашим сведениям не было опубликовано никаких исследований in vitro по эстрогенности или антиэстрогенности секоизоларициресинола, матаирезинол, арктигенина или ГМР в клетках рака молочной железы. Однако сообщалось, что секоизоларициресинол и матаирезинол уменьшают активность связывания СГСГ с  дигидротестостероном [59,60],и действуют как слабые ингибиторы ароматазы. В эмбриональных клетках почек человека, трансфицированных ароматазой человека, величины IC50 для секоизоларициресинола, матаирезинола и ГМР превышали 10 M [38]. В силу этого понимание возможного влияния лигнанов как эндокринных модуляторов далеко от завершения.

Доступные несколько исследований о влиянии очищенных лигнанов как эндокринных модуляторов in vivo. Краткосрочное испытание на рост матки у крыс чаще всего используют для проверки эстрогенности соединений рациона. Выдача в течение семи дней секоизоларициресинола, матаирезинола, ГМР или ЭНЛ (50 мг/кг массы тела) не увеличила массу матки [38]. При краткосрочном (7 дней) испытании любой из этих лигнанов также не смог ингибировать рост матки, индуцированный андростендионом (т.е. ингибитором ароматазы). В соответствии с ранее полученными результатами, ввод ГМР (50 мг/кг массы тела) не повлиял на рост матки. Подобным образом краткосрочная выдача НТГ (50 мг/кг массы тела) также не повлияла на массу матки. Однако наблюдалось модулирующее влияние НТГ на рост матки у неполовозрелых крыс при продолжительной выдаче лигнана, т.е. в течение беременности и лактации до отъёма. Соответственно, у взрослых не овариэктомизированных ДМБА-индуцированных самок крыс долгосрочная (9 недель) выдача НТГ привела к повышению массы матки по сравнению с контрольной группой. Из этих результатов можно предположить, что долгосрочное воздействие НТГ приводит к слабой эстроген-подобной реакцию роста матки самок крыс. В отличие от НТГ, продолжительное воздействие ГМР (напр., начиная с периода беременности и продолжившееся до отъёма) не вызвало какой-либо утеротропной реакции у неполовозрелых крыс возрастом 21 день в сравнении с контрольной группой. Соответственно, долгосрочное (9 недель) введение ГМР также значительно не увеличило массу матки не овариэктомизированных ДМБА-индуцированных самок крыс [24,25].

Кроме длительности воздействия может быть важным возраст при воздействии. Как при СДГ[61], так и при НТГ, лишь у животных, подвергавшихся воздействию в предродовой период, наблюдали повышенную массу матки перед половой зрелость, тогда как воздействие лишь в течение лактации [62] или 18-24 день ПНП не дало результатов. В отличие от НТГ, воздействие ГМР в течение беременности и лактации не вызвало утеротропной реакции у неполовозрелых самок. Соответственно у беременных крыс выдача рациона, содержащего ГМР (0,25, 1 или 4%), в течение беременности не повлияло на массу матки самок [63]. В отличие от СДГ и НТГ, эти результаты не выявили утеротропной реакции при вводе ГМР in vivo на любой стадии предродового или послеродового периода или у беременных самок.

Модулирующее влияние НТГ на эндокринную систему также наблюдалось у самцов крыс. Долгосрочное воздействие НТГ, начавшееся с периода беременности и продолжившееся до достижения возраста примерно 5 месяцев, значительно повысило массу вентральной доли предстательной железы и проявило тенденцию к повышению массы семенных пузырьков и свёртывающей железы у взрослых самцов крыс. Значительные изменения наблюдали только после долгосрочного воздействия НТГ. Не наблюдали разницы в массе органов размножения между неполовозрелыми самцами крыс возрастом 21 день и крыс возрастом 2 месяца. Как уже упоминалось, в отличие от НТГ долгосрочное воздействие ГМР не привело к существенным различиям в массе органов размножения, что также предполагает отсутствие модулирующего влияния ГМР на эндокринную систему на самцов крыс.

Выводы

В нашем настоящем исследовании показываться, что минимальное различие в химической структуре приводят к большим различиям в метаболизме и биологической активности лигнанов. В отличие от ГМР, НТГ не ингибировал ДМБА-индуцированные опухоли молочной железы в течение активации и раннего прогрессирования, и при долгосрочных экспериментах показал низкое модулирующее влияние на эндокринную систему при отсутствии влияния ГМР. Более того, в отличие от ГМР, НТГ не метаболизируется в ЭНЛ. Очевидно, все наблюдаемые эффекты от растительных лигнанов нельзя объяснить исключительно разницей в образовании ЭНЛ. Существуют достоверные свидетельства того, что противоопухолевые свойства растительных лигнанов связаны с формированием ЭНЛ, но нельзя сделать подобный вывод в отношении модулирующего влияния на эндокринную систему. Очевидно, что необходимо учитывать влияние растительных лигнанов, которые поглощаются сами по себе (напр, ГМР и НТГ). Весьма вероятно, что индивидуальные профили лигнанов, а также наблюдаемое модулирующее влияние на гормоны являются очень сложными и зависят от многих факторов (т.е., воздействующий лигнан, возраст в ходе воздействия, время воздействия, индивидуальные характеристики метаболизма, разница в распределении в тканях и т.д.) Таким образом, ещё предстоит выяснить механизм(-ы), которые объясняют разницу в росте опухоли молочной железы, а также модулирующее влияние НТГ и ГМР на эндокринную систему.

Выражение признательности

Приносим благодарность профессору Risto Santti (кафедра анатомии, Университет Турку, Турку, Финляндия) за очень ценные объяснения, советы и комментарии в   ходе работы. Выражаем благодарность д-ру Jie-Xian Zhang (кафедра здравоохранения и клинической медицины, Университет Умео, Швеция) за подготовку рационов для долгосрочного эксперимента ГМР. Мы благодарны маг. ест. наук Saija Savolainen, маг. ест. наук Jenni Bernoulli и д-ру Anni Wa¨rri (Институт биомедицины и Форум по функциональным пищевым продуктам, Университет Турку) за оказанную помощь в экспериментах над животными. Мы признательны маг. ест. наук Christer Eckerman и г-ну Markku Reunanen (Лаборатория химической обработки древесины и бумаги, Академия Або,Турку,Финляндия) за выделения лигнанов для данных исследований и проведения анализов методом ГХ-МС соответственно, а также Timo Leino за пальпацию опухоли. Данные исследования финансировались TEKES, Национальным технологическим агентством Финляндии (проекты  40078/01 и 40056/03), а также тематической сетью Phytohealth в ЕС (QLK1- CT-2002).

Список литературы

[1] L.U. Thompson, P. Robb, M. Serraino, F. Cheung, Mammalian lignan production from various foods, Nutr. Cancer 16 (1) (1991) 43–52.

[2] W. Mazur, T. Fotsis, K. Wa¨ha¨la¨, S. Ojala, A. Salakka, H. Adlercreutz, Isotope dilution gas chromatographic–mass spectrometric method for the determination of isoflavonoids, coumestrol, and lignans in food samples, Anal. Biochem. 233 (2) (1996) 169–180.

[3] M. Axelson, J. Sjo¨vall, B.E. Gustafsson, K.D.R. Setchell, Origin of lignans in mammals and identification of a precursor from plants, Nature 298 (12) (1982) 659–660.

[4] S.P. Borriello, K.D.R. Setchell, M. Axelson, A.M. Lawson, Produc- tion and metabolism of lignans by the human faecal flora, J. Appl. Bacteriol. 58 (1) (1985) 37–43.

[5] S. Heinonen, T. Nurmi, K. Liukkonen, K. Poutanen, K. Wa¨ha¨la¨, T. Deyama, S. Nishibe, H. Adlercreutz, In vitro metabolism of plant lignans: new  precursors  of mammalian  lignans  enterolactone and enterodiol, J. Agric. Food Chem. 49 (7) (2001) 3178–3186.

[6] D. Ingram, K. Sanders, M. Kolybaba, D. Lopez, Case-control study of phyto-oestrogens and breast cancer, Lancet 350 (9083) (1997)

990–994.

[7] P. Pietinen, K. Stumpf, S. Mannisto, B. Kataja, M. Uusitupa, H. Adlercreutz, Serum enterolactone and risk of breast cancer: a case- control study in eastern Finland, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 10 (4) (2001) 339–344.

[8] Q. Dai, A.A. Franke, F. Jin, X.O. Shu, J.R. Hebert, L.J. Custer,

J. Cheng, Y.T. Gao, W. Zheng, Urinary excretion of phytoestrogens and risk of breast cancer among Chinese women in Shanghai, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 11 (9) (2002) 815–821.

[9] S.E. McCann, K.B. Moysich, J.L. Freudenheim, C.B. Ambrosone,

P.G. Shields, The risk of breast cancer associated with dietary lignans differs by CYP17 genotype in women, J. Nutr. 132 (10) (2002) 3036–3041.

[10] J. Linseisen, R. Piller, S. Hermann, J. Chang-Claude, German case- control study dietary phytoestrogen intake and premenopausal breast cancer risk in a German case-control study, Int. J. Cancer 110 (2) (2004) 284–290.

[11] S.E. McCann, P. Muti, D. Vito, S.B. Edge, M. Trevisan, J.L. Freuden- heim, Dietary lignan intakes and risk of pre-and postmenopausal breast cancer, Int. J. Cancer 111 (2004) 440–443.

[12] A. Kilkkinen, J. Virtamo, E. Vartiainen, R. Sankila, M.J. Virtanen,

H. Adlercreutz, P. Pietinen, Serum enterolactone concentration is not associated with breast cancer risk in a nested case-control study, Int. J. Cancer 108 (2) (2004) 277–280.

[13] A. Zeleniuch-Jacquotte, H. Adlercreutz, R.E. Shore, K.L. Koenig, I. Kato, A.A. Arslan, P. Toniolo, Circulating enterolactone and risk of breast cancer: a prospective study in New York, Br. J. Cancer 91 (1) (2004) 99–105.

[14] K. Hulten, A. Winkvist, P. Lenner, R. Johansson, H. Adlercreutz, G. Hallmans, An incident case-referent study on plasma enterolactone and breast cancer risk, Eur. J. Nutr. 1 (4) (2002) 168–176.

[15] I. den Tonkelaar, L. Keinan-Boker, P.V. Veer, C.J. Arts, H. Adler- creutz, J.H. Thijssen, P.H. Peeters, Urinary phytoestrogens and post- menopausal breast cancer risk, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 10 (3) (2001) 223–228.

[16] P.L. Horn-Ross, E.M. John, M. Lee, S.L. Stewart, J. Koo, L.C. Sakoda, A.C. Shiau, J. Goldstein, P. Davis, E.J. Perez-Stable, Phytoestrogen consumption and breast cancer risk in a multiethnic pop- ulation: the Bay Area Breast Cancer Study, Am. J. Epidemiol. 154 (5) (2001) 434–441.

[17] P.L. Horn-Ross, K.J. Hoggatt, D.W. West, M.R. Krone, S.L. Stewart,

H. Anton, C.L. Bernstei, D. Deapen, D. Peel, R. Pinder, P. Reynolds, R.K. Ross, W. Wright, A. Ziogas, Recent diet and breast cancer risk: the California Teachers Study (USA), Cancer Causes Control 13 (5) (2002) 407–415.

 [18] L. Keinan-Boker, Y.T. van Der Schouw, D.E. Grobbee, P.H. Peeters, Dietary phytoestrogens and breast cancer risk, Am. J. Clin. Nutr. 79 (2) (2004) 282–288.

[19] S. Willfo¨r, J. Hemming, M. Reunanen, C. Eckerman, B. Holmbom, Lignans and lipophilic extractives in Norway spruce knots and stem- wood, Holzforsch 57 (2003) 27–36.

[20] A. Smeds, K. Hakala, Liquid chromatographic–tandem mass spec- trometric method for the plant lignan 7-hydroxymatairesinol and its potential metabolites in human plasma, J. Chromatogr. B Anal. Tech- nol. Biomed. Life Sci. 793 (2) (2003) 297–308.

[21] J.L. Penalvo, T. Nurmi, K. Haajanen, N. Al-Maharik, N. Botting,

H. Adlercreutz, Determination of lignans in human plasma by liquid chromatography with coulometric electrode array detection, Anal. Biochem. 332 (2) (2004) 384–393.

[22] R. Ekman, S. Willfo¨r, R. Sjo¨holm, M. Reunanen, J. Ma¨ki, R. Lehtila¨,

C. Eckerman, Identification of the lignan nortrachelogenin in knot and branch heartwood of Scots pine (Pinus sylvestris L.), Holzforsch 56 (2002) 253–256.

[23] S. Willfo¨r, J. Hemming, M. Reunanen, B. Holmbom, Phenolic and lipophilic extractives in Scots pine knots and stemwood, Holzforsch 57 (2003) 359–372.

[24] N.M. Saarinen, A. Warri, S.I. Makela, C. Eckerman, M. Reunanen,

M. Ahotupa, S.M. Salmi, A.A. Franke, L. Kangas, R. Santti, Hy- droxymatairesinol, a novel enterolactone precursor with antitumor properties from coniferous tree (Picea abies), Nutr. Cancer 36 (2) (2000) 207–216.

[25] N.M. Saarinen, R. Huovinen, A. Warri, S.I. Makela, L. Valentin- Blasini, L. Needham, C. Eckerman, Y.U. Collan, R. Santti, Uptake and metabolism of hydroxymatairesinol in relation to its anticarcino- genicity in DMBA-induced rat mammary carcinoma model, Nutr. Cancer 41 (1–2) (2001) 82–90.

[26] A.I. Smeds, N.M. Saarinen, T. Toivonen, P. Penttinen, R.E. Sjo¨holm,

S.I. Ma¨kela¨, Urinary excretion of lignans after administration of iso- lated plant lignans to rats: the effect of single dose and 10-day exposures, J. Chromatogr. B 13 (2004) 303–312.

[27] S. Katsuda, M. Yoshida, N. Saarinen, A. Smeds, D. Nakae, R. Santti,

A. Maekawa, Chemopreventive effects of hydroxymatairesinol on uterine carcinogenesis in Donryu rats, Exp. Biol. Med. (Maywood) 229 (5) (2004) 417–424.

[28] S.I. Oikarinen, A. Pajari, M. Mutanen, Chemopreventive activity of crude hydroxsymatairesinol (HMR) extract in Apc(Min) mice, Can- cer Lett. 161 (2) (2000) 253–258.

[29] K.H. Lee, K. Tagahara, H. Suzuki, R.Y. Wu, M. Haruna, I.H. Hall,

H.C. Huang, K. Ito, T. Iida, J.S. Lai, Antitumor agents: 49 tricin, kaempferol-3-O-beta-d-glucopyranoside and (+)-nortrachelogenin, antileukemic principles from Wikstoemia indica, J. Nat. Prod. 44 (1981) 530–535.

[30] S.O. Mueller, S. Simon, K. Chae, M. Metzler, K.S. Korach, Phy- toestrogens and their human  metabolites  show  distinct  agonis- tic and antagonistic properties on estrogen receptor alpha (ERal- pha) and ERbeta in human cells, Toxicol. Sci. 80 (1) (2004) 14–

25.

[31] W.V. Welshons, C.S. Murphy, R. Koch, G. Calaf, V.C. Jordan, Stim- ulation of breast cancer cells in vitro by the environmental estrogen enterolactone and the phytoestrogen equol, Breast Cancer Res. Treat. 10 (2) (1987) 169–175.

[32] N. Sathyamoorthy, T.T.Y. Wang, J.M. Phang, Stimulation of pS2 expression by diet-derived compounds, Cancer Res. 54 (4) (1994)

957–961.

 [33] C. Wang, M.S. Kurzer, Phytoestrogen concentration determines ef- fects on DNA synthesis in human breast cancer cells, Nutr. Cancer 28 (3) (1997) 236–247.

[34] Y. Mousavi, H. Adlercreutz, Enterolactone and estradiol inhibit each other’s proliferative effect on MCF-7 breast cancer cells in culture, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 41 (3–8) (1992) 615–619.

[35] H. Adlercreutz, Y. Mousavi, J. Clark, K. Ho¨ckerstedt, E. Ha¨ma¨la¨inen,

K. Wa¨ha¨la¨, T. Ma¨kela¨, T. Hase, Dietary phytoestrogens and cancer: in vitro and in vivo studies, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 41 (3–8) (1992) 331–337.

[36] H. Adlercreutz, C. Bannwart, K. Wa¨ha¨la¨, T. Ma¨kela¨, G. Brunow, T. Hase, P.J. Arosemena, J.T. Kellis, L.E. Vickery, Inhibition of human aromatase by mammalian lignans and isoflavonoid phytoestrogens,

J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (2) (1993) 147–153.

[37] C. Wang, T. Ma¨kela¨, T. Hase, H. Adlercreutz, M.S. Kurzer, Lignans and flavonoids inhibit aromatase enzyme in human preadipocytes, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 50 (3–4) (1994) 205–212.

[38] N.M. Saarinen, R. Huovinen, A. Warri, S.I. Makela, L. Valentin- Blasini, R. Sjoholm, J. Ammala, R. Lehtila, C. Eckerman, Y.U. Collan, R.S. Santti, Enterolactone inhibits the growth of 7,12- dimethylbenz(a)anthracene-induced mammary carcinomas in the rat, Mol. Cancer Ther. 10 (2002) 869–876.

[39] K. Wa¨ha¨la¨, T. Ma¨kela¨, R. Ba¨ckstro¨m, G. Brunow, T. Hase, Synthesis of the [2H]-labelled urinary lignans, enterolactone and enterodiol, and the phytoestrogen daidzein and its metabolites equol and O— desmethylangolensin, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1986) 95–98.

[40] H.  Adlercreutz,  T.  Fotsis,  C.  Bannwart,  K.  Wahala,  G.  Brunow,

T. Hase, Isotope dilution gas chromatographic–mass spectrometric method for the determination of lignans and isoflavonoids in human urine, including identification of genistein, Clin. Chim. Acta 199 (3) (1991) 263–278.

[41] A. Bylund, N. Saarinen, J.-X. Zhang, A. Bergh, A. Widmark, A. Johansson, E. Lundin, H. Adlercreutz, G. Hallmans, P. Stattin, S. Ma¨kela¨, Anticancer effects of a plant lignan 7-hydroxymatiareisnolin on a prostate cancer model in vivo, Exp. Biol. Med., in press.

[42] N. Saarinen, S.C. Joshi, M. Ahotupa, X. Li, J. A¨ mma¨la¨, S. Ma¨kela¨,

R. Santti, No evidence for the in vivo activity of aromatase-inhibiting flavonoids, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 78 (3) (2001) 231–239.

[43] C.W. Welsch, Host factors affecting the growth of carcinogen- induced rat mammary carcinomas: a review and tribute to Charles Brenton Huggins, Cancer Res. 45 (8) (1985) 3415–3443.

[44] V.C. Jordan, K.E. Nayloor, C.J. Dix, G. Prestwich, Anti-oeastrogen action in experimental breast cancer, Recent Results Cancer Res. 71 (1980) 30–44.

[45] M. Dukes, The relevance of preclinical models to the treatment of postmenopausal breast cancer, Oncology 54 (Suppl. 2) (1997) 6–10.

[46] K. Schieweck, A.S. Bhatnagar, C. Batzl, M. Lang, Anti-tumor and endocrine effects of non-steroidal aromatase inhibitors on estrogen- dependent rat mammary tumors, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 44 (4–6) (1993) 633–636.

[47] N. Hirose, F. Doi, T. Ueki, K. Akazawa, K. Chijiiwa, M. Sugano,

K. Akimoto, S. Shimizu, H. Yamada, Suppressive effect of sesamin against 7,12-dimethylbenz[a]-anthracene induced rat mammary car- cinogenesis, Anticancer Res. (1992) 1259–1266.

[48] L.U. Thompson, M.M. Seidl, S.E. Rickard, L.J. Orcheson, H.H. Fong, Antitumorigenic effect of a mammalian lignan precursor from flaxseed, Nutr. Cancer 26 (2) (1996) 159–165.

[49] L.U. Thompson, S.E. Rickard, L.J. Orcheson, M.M. Seidl, Flaxseed and its lignan and oil componenets reduce mammary tumor growth at a late stage of carcinogenesis, Carcinogenesis 17 (1996) 1373– 1376.

[50] S.E. Rickard, Y.V. Yuan, J. Chen, L.U. Thompson, Dose effects of flaxseed and its lignan on N-methyl-N-nitrosourea-induced mammary tumorigenesis in rats, Nutr. Cancer 35 (1) (1999) 50–57.

[51] M. Hirose, T. Yamaguchi, C. Lin, N. Kimoto, M. Futakuchi, T. Kono,

S. Nishibe, T. Shirai, Effects of arctiin on PhIP-induced mammary, colon and pancreatic carcinogenesis in female Sprague–Dawley rats and MeIQx-induced hepatocarcinogenesis in Male F344 rats, Cancer Lett. 155 (2000) 79–88.

[52] Y.  Kitamura, M.  Yamagishi,  K. Okazaki,  H.Y.  Son, T.  Imazawa,

A. Nishikawa, T. Iwata, Y. Yamauchi, M. Kasai, K. Tsutsumi, M. Hirose, Lack of significant inhibitory effects of a plant lignan trache- loside on 2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)- induced mammary carcinogenesis in female Sprague–Dawley rats, Cancer Lett. 200 (2) (2003) 133–139.

[53] S.E. Rickard, L.J. Orcheson, M.M. Seidl, L. Luyengi, H.H. Fong,

L.U. Thompson, Dose-dependent production of mammalian lig- nans in rats and in vitro from the purified precursor secoisolar- iciresinol diglycoside in flaxseed, J. Nutr. 126 (8) (1996)  2012– 2019.

[54] M. Nose, T. Fujimoto, S. Nishibe, Y. Ogihara, Structural transforma- tion of lignan compounds in rat gastrointestinal tract. Part II: serum concentration of lignans and their metabolites, Planta Med. 59 (1993) 131–134.

[55] P.C. Eklund, S.M. Willfor, A.I. Smeds, F.J. Sundell, R.E. Sjoholm,

B.R. Holmbom, A new lariciresinol-type butyrolactone lignan de- rived from hydroxymatairesinol and its identification in spruce wood, J. Nat. Prod. (6) (2004) 927–931.

[56] A.I. Smeds, N.M. Saarinen, P.C. Eklund, R.E. Sjo¨holm, S.I. Ma¨kela¨, New lignan metabolites in rat urine, J. Chromatogr. B, in press.

 [57] M. Scho¨ttner, D. Gansser, G. Spiteller, Interaction of lignans with human sex hormone binding globulin (SHBG), Z. Naturforsch [C] 52 (11–12) (1997) 834–843.

[58] B.A. Evans, K. Griffiths, M.S. Morton, Inhibition of 5-alpha- reductase in genital skin fibroblasts and prostate tissue by dietary lignans and isoflavonoids, J. Endocrinol. 147 (2) (1995) 295–302.

[59] D. Gansser, G. Spiteller, Plant constituents interfering with human sex hormone-binding globulin. Evaluation of a test method and its application to Urtica dioica root extracts, Z. Naturforsch [C] 50 (1–2) (1995) 98–104.

 [60] M. Scho¨ttner, G. Spiteller, D. Gansser, Lignans interfering with 5- alpha-dihydrotestosterone binding to human sex hormone-binding globulin, J. Nat. Prod. 61 (1) (1998) 119–121.

[61] J.C. Tou, J. Chen, L.U. Thompson, Flaxseed and its lignan precursor, secoisolariciresinol diglycoside, affect pregnancy outcome and repro- ductive development in rats, J. Nutr. 128 (11) (1998) 1861–1868.

[62] W.E. Ward, J. Chen, L.U. Thompson, Exposure to flaxseed or its purified lignan during suckling only or continuously does not al- ter reproductive indices in male and female offspring, J. Toxicol. Environ. Health A 64 (7) (2001) 567–577.

[63] A.P. Wolterbeek, A. Roberts, H. Korte, M. Unkila, D.H. Waalkens-Berendsen, Prenatal developmental toxicity study with 7- hydroxymatairesinol potassium acetate (HMRlignan) in rats, Regul. Toxicol. Pharmacol. 40 (1) (2004) 1–8.